دانشکده علوم

پايان نامه کارشناسي ارشد در رشته زيست شناسي (علوم سلولي و مولکولي)

توليد و بررسي خصوصيات بيوشيميايي آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس 1390 BR

به کوشش
سيده مائده ميرتبار درزي

استاد راهنما
دکتر حميدرضا کربلايي حيدري

اسفند ماه 92

به نام خدا

اظهارنامه
اينجانب سيده مائده ميرتبار درزي (900503) دانشجوي رشته زيست شناسي گرايش علوم سلولي و ملکولي دانشکده علوم دانشگاه شيراز اظهار مينمايم که اين پاياننامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي که از منابع ديگران استفاده کردهام، نشاني دقيق و مشخصات کامل آن را نوشتهام. همچنين اظهار ميکنم که تحقيق و موضوع پاياننامهام تکراري نيست و تعهد مينمايم که بدون مجوز از دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. کليه حقوق اين اثر مطابق با آيين نامه مالکيت فکري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.

نام و نام خانوادگي: سيده مائده ميرتبار درزي
تاريخ و امضاء: 18/12/92

تقديم به او
که سرچشمهي زلال حقيقت است.
به او که در وسعت بيکران حضورش، آرام آرام باليدم
و در شعلههاي دانايياش تاريکيهاي جهالتم را روشن ساختهام.

تقديم به پدرم
به ستون استوار زندگيام،
که هرجا قدمهايم لرزيده است، به بلنداي جاودان مهربانياش تکيه دادهام.

تقديم به مادرم
به ساکن آشناي قلب تپندهام.
تقديم به فروغ آشناي چشمهايش،
که لحظه لحظههاي بودنم در ايثار بيدريغ دعاهايش محصور گشته است.

تقديم به برادرانم
که در تمام زندگيام به اعتماد بودنشان سربلند بودهام.

سپاسگزاري
سپاس ايزد منان را، که به من توفيق رسيدن به اين مرحله تحصيلي را عطا فرمود. به جاست تا دراين مختصر، قدران زحمات پدر و مادر عزيزم که گرماي اميدبخش وجودشان بهترين پشتيبان من بوده و حضور برادران عزيزم در کنارم، که خستگي‌هاي اين راه را به اميد و روشني راه تبديل مي‌کرد. همچنين قدردان زحمات استاد راهنماي ارجمندم جناب آقاي دکتر حميد رضا کربلايي حيدري هستم که علاوه بر علم، درس زندگي را به من آموختند.

چکيده

بهينه سازي توليد و بررسي خصوصيات بيوشيميايي آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس 1390BR

در پژوهش حاضر ترشح و بررسي خصوصيات آلفا آميلاز خارج سلولي از باکتري بومي باسيلوس ليکنيفورميس 1390BR مد نظر بود. سويه 1390BR در محيط حاوي عصاره مخمر 5/0%، پپتون 5/0% و کلريد سديم 5/0% و آب شهر 5% در دماي ?C30 و 7~pH کشت داده شد و پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت، توسط نشاسته 1/0 % القا گرديد. نتايج بيشترين ميزان ترشح را 18 ساعت پس از القا نشان داد. آنزيم توسط روش رسوبدهي با استن (v/v)70% و ستون کروماتوگرافي تعويض يونيDEAE-Cellulose تا حد امکان تخليص گرديد. خصوصيات بيوشيميايي آنزيم تخليص شده در حضور 5/0% نشاسته نشان داد pH و دماي بهينه آنزيم به ترتيب 0/6 و ?C 70 ميباشد و در دماي ?C 85 پس از گذشت يک ساعت کمتر از 25% فعاليت خود را از دست ميدهد. اين آنزيم در محدوده وسيعي از pH (5-12) بيش از 60% فعاليت خود را حفظ ميکند. پارامترهاي سينتيکي Vmax و Km آلفا آميلاز سويه 1390BR به ترتيب برابر µM/s 42/0 و mg/ml 02/1 محاسبه شد. فعاليت آنزيم در حضور يونهاي Mn2+ و Ca2+ بمدت يک ساعت به ميزان 105 و 107% افزايش مييابد و در حضورFe3+ بطور کامل مهار گرديد. فعاليت آميلوليتيک آنزيم در حضور mM5EDTA سبب کاسته شدن تنها 27% از فعاليت اوليه آنزيم گرديد. پايداري آنزيم در محدوده وسيع دما و pH و عدم وابستگي شديد فعاليت آنزيم به حضور يون Ca2+ در محيط، اين آنزيم را يک کانديد مناسب براي جايگزيني بعضي از آميلازهاي صنعتي امروزي مينمايد.
کلمات کليدي: آلفا آميلاز، باسيلوس ليکنيفورميس، پايداري دمايي، صنعت نشاسته

فهرست مطالب

عنوان صفحه
فصل اول1
(مقدمه)1
1- مقدمه2
1-1- آنزيمها2
1-2- منابع بيوکاتاليزوري2
1-2-1- کاربردهاي صنعتي بيوکاتاليزورها4
1-3- نشاسته5
1-4- آميلازها6
1-4-1- منابع آلفا آميلازها7
1-4-1-1- آميلازهاي باکتريايي7
1-4-1-2- آميلازهاي قارچي7
1-4-2- طبقه بندي آميلازها8
آنزيمهاي هيدروليز کننده نشاسته به چهار گروه عمومي تقسيم ميشوند:8
الف) اندو آميلازها8
ب) اگزو آميلازها8
ج) آنزيمهاي شاخه شکن8
د) تراسفرازها8
1-4-2-1- اندو آميلازها8
1-4-2-2- اگزو آميلازها9
1-4-2-3- آنزيمهاي شاخه شکن9
1-4-3- ساختار آميلازها11
1-4-4- مکانيسم عمل آلفا-آميلاز13
1-4-5- کاربردهاي آلفا-آميلازها14
1-4-5-1- توليد اتانل زيستي15
1-4-5-2- صنايع شوينده16
1-4-5-3- صنايع نساجي16
1-4-5-4- کاغذ سازي17
1-4-5-5- صنايع غذايي17
1-5-4-6- توليد نان و شيريني پزي17
1-4-5-7- توليد شربت گلوکز و فروکتوز18
فصل دوم20
2- مروري بر پژوهش¬هاي پيشين21
فصل سوم25
3- ابزار، مواد و روشهاي تحقيق26
3-1- ابزار27
3-2- مواد28
3-2-1- بافرها28
3-2-2- مواد شيميايي28
3-2-3- محيطهاي کشت مورد نياز28
3-1-4-کشت باکتري مولد آلفا آميلاز و تشخيص کيفي توليد آنزيم خارج سلولي30
3-2- بررسي سينتيک رشد و فعاليت آلفا آميلازي باکتري در محيط کشت پايه30
3-3- روشهاي استفاده شده در مراحل سنجش و تخليص آلفا آميلاز31
3-3-1- تخليص آنزيم آلفا آميلاز31
3-3-2- تخليص بر روي ستون DEAE-Cellulose31
3-3-3- سنجش فعاليت آنزيمي32
3-3-3-1-روش سنجش فعاليت آنزيم33
3-3-3-2-واحد آنزيمي33
3-3-4- سنجش پروتئين34
3-3-4-1- سنجش کمي پروتئين به روش برادفورد34
3-4- روشهاي بررسي خصوصيات بيوشيميايي آلفا آميلاز با خلوص نسبي35
3-4-1- اثر غلظتهاي مختلف سوبسترا بر فعاليت آلفا آميلاز (تعيين Km و Vm)35
3-4-2- اثر دما بر فعاليت آلفا آميلاز با خلوص نسبي37
3-4-3- اثر pH بر فعاليت آلفا آميلاز37
3-4-4- بررسي پايداري حرارتي آنزيم داراي خلوص نسبي37
3-4-5- اثر pH بر پايداري آنزيم داراي خلوص نسبي37
3-4-6- روش بررسي اثر يونهاي فلزي و EDTA بر فعاليت آنزيمي38
4- نتايج40
4-1- ترشح آنزيم آلفا آميلاز از باسيلوس ليکنيفورميس سويه 1390BR40
4-2- سينتيک رشد و توليد آنزيم آلفا آميلاز41
4-3- تخليص و شناسايي آنزيم آلفا آميلاز از باسيلوس ليکنيفورميس 1390BR42
4-4- خصوصيات بيوشيميايي آلفا آميلاز43
4-4-1- اثر pH و دما بر فعاليت آلفا اميلاز43
4-4-2- اثر دما بر پايداري آلفا آميلاز سويه 1390 BR44
4-4-3- اثر pH بر پايداري آنزيم آلفا آميلاز45
4-6- اثر غلظتهاي مختلف سوبسترا بر فعاليت آميلاز 1390BR ( تعيين Km و Vmax)46
4-7- اثر يونهاي فلزي بر فعاليت آنزيم47
5- بحث و نتيجه گيري50
پيشنهادات54

فهرست جدولها

عنوان صفحه
جدول 1- 1. کاربردهاي مختلف آنزيمها.4
جدول 1-3) ترکيبات بافر Mix28
جدول 3-2) نام و اجزاء محيط کشتهاي مورد استفاده.29
جدول 3-2) اجزاء محيط کشت جامد29
جدول 3-3. موادلازم در تهيه محلول برادفورد.35
جدول 4-1) اثر يونهاي فلزي بر فعاليت آنزيم.48

فهرست شکلها

عنوان صفحه
شکل 1-1) منابع تجاري آنزيمها.3
شکل 1-2) گرانول نشاسته در گياهان مختلف (الف: نشاسته سيب زميني شيرين، ب: نشاسته سيب زميني، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج)5
شکل 1-3) ساختار آميلوز (الف) و آميلوپکتين(ب).6
شکل 1-4) انواع آميلازها و عملکرد و محصول آنها.10
شکل 1-5) دُمينهاي A، B و Cو اسيد آمينههاي کاتاليتيک در آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس12
شکل 1-6) يونهاي کلسيم در ساختار آلفا آميلاز.13
شکل 4-1) کلني باکتري 1390BR در محيط نشاسته- آگار. هاله تشکيل شده اطراف کلنيها نشان دهنده فعاليت آلفا آميلازي ميباشد.40

فهرست نمودارها

عنوان صفحه
نمودار 3-1) منحني استاندارد غلظتهاي مختلف D-مالتوز در طول موج nm 54034
نمودار 4-1) رشد باکتري 1390BR41
نمودار 4-2) توليد آنزيم برحسب زمان پس از القا نشاسته 1/0%41
نمودار 4-3) کروماتوگرام ستون DEAE Cellulose42
نمودار 4-4( اثر pH بر فعاليت آلفا آميلاز در دماي ?C 70. فعاليت نسبي به عنوان درصدي از حداکثر فعاليت ديده شده در0/6 ~pH ميباشد که 100% در نظر گرفته شده است.43
نمودار 4-5( اثر دما بر فعاليت آنزيم در0/ 7~pH. فعاليت نسبي به عنوان درصدي از حداکثر فعاليت ديده شده در دماي ?C 70 ميباشد که 100% در نظر گرفته شده است.44
نمودار 4-6) پايداري فعاليت آنزيمي در دماهاي مختلف در طي زمان45
نمودار 4-7) پايداري آلفا آميلاز در pH مختلف پس از يک ساعت انکوباسيون45
نمودار 4-8) نمودار ميکائيليس- منتن 46
نمودار 4-9) نمودار هانس- ولف47

فصل اول
(مقدمه)

1- مقدمه
1-1- آنزيمها
آنزيمها، پروتئينهاي کروي و مسئول بسياري از واکنشهاي ضروري بيوشيميايي در ميکروارگانيسمها، گياهان و جانوران هستند. آنزيمها نقشهاي مختلفي ايفا ميکنند و بدون اينکه خودشان تغيير يابند، توانايي منحصر به فردي در تسـهيل و تسـريع واکنش شيميايي دارند (Mojsov et al., 2012).
در سيستم طبقه بندي بين المللي آنزيمها1 براساس عملکرد به شش دسته تقسيم ميشوند:
EC1: اکسيدوردوکتازها؛ کاتاليز واکنشهاي اکسيداسيون- احيا
EC2: ترانسفرازها؛ کاتاليز انتقال گروههاي عاملي
EC3: هيدرولازها؛ کاتاليز آبکافت پيوندها
EC4: ليازها؛ افزودن گروهها به پيوند دوگانه يا ايجاد پيوندهاي دوگانه با برداشت گروه
EC5: ايزومرازها؛ کاتاليز ايزومريزاسيون درون يک ملکول
EC6: ليگازها؛ کاتاليز اتصال کووالان دو ملکول همراه با تجزيهATP .

1-2- منابع بيوکاتاليزوري
آنزيمها از منابع ميکروبي، حيواني و گياهي بدست ميآيند. منابع ميکروبي شامل باکتريها، قارچها و مخمرها هستند که 80 درصد کل آنزيمها از اين منابع تأمين ميشود. منابع گياهي و جانوري نه تنها محدود هستند بلکه فرايند خالصسازي آنها نيز دشوارتر ميباشد. همچنين به دليل داشتن خاصيت ايمنوژنيسيتي2 در کاربردهاي باليني کمتر مورد استفاده قرار ميگيرند. در حالي که آنزيمهاي ميکروبي فاقد اين محدوديت ميباشند و در فرايند تخمير به مقدار زياد توليد ميشوند. آنزيمهاي ميکروبي اغلب خارج سلولي هستند و جداسازي آنها بسيار راحتتر است و در مقايسه با آنزيمهاي گياهي و جانوري پايدارتر ميباشد. ميکروارگانيسمها براي توليد آنزيم از مواد ارزان قيمت و در دسترس استفاده ميکنند. منابع مورد استفاده در فرايند تخمير براي توليد آنزيم بايد ارزان قيمت باشد تا آنزيم توليدي براي کاربردهاي صنعتي مربوطه مقرون به صرفه باشد. همچنين دستکاري ژنتيکي ميکروارگانيسمها آسانتر بوده و سرعت توليد در اين بيوکاتاليزورها بسيار بالاست.

شکل 1-1) منابع تجاري آنزيمها.

1-2-1- کاربردهاي صنعتي بيوکاتاليزورها
قرنهاست که مواد غذايي مانند نان، پنير، ماست و سرکه از طريق فرايندهاي بيولوژيک توليد ميشود. به دليل عدم امکان استفاده از اسيدها و بازهاي قوي، حلالها يا کاتاليزورهاي شيميايي سمّي در اين صنعت، کاربرد آنزيمهاي ميکروبي بسيار گسترش يافته است. جدول 1-1 برخي از کاربردهاي صنعتي آنزيمهاي مختلف را نشان ميدهد.
جدول 1- 1. کاربردهاي مختلف آنزيمها.
مورد استفاده آنزيم الکل ?-آميلاز، ?-آميلاز، پروتئاز، آميلوگلوکوزيداز اسيد آمينه اسيد آمينه آسيلاز غذاي حيوانات ?-گلوکاناز، همي سلولازها، آميلاز، پروتئاز، فيتاز نان ?-آميلاز، ?-آميلاز، ?-گلوکاناز، پروتئاز پنير سازي رنت، ليپاز، پروتئاز شويندهها پروتئاز، ليپاز، آميلاز وسلولاز قليايي محصولات فر آوري شدهي تخم مرغ گلوکز اکسيداز، کاتالاز، ليپاز آب ميوه پکتيناز، همي سلولازها، سلولاز، آميلاز لاکتوز لاکتاز مخمري چرم پروتئاز، کربوهيدراتاز، ليپاز ليپيد ليپاز گوشت پروتئاز فاضلاب پروتئاز، سلولاز، مخلوط آنزيمي

1-3- نشاسته
پس از سلولز، نشاسته دومين پليساکاريد اصلي موجود در طبيعت است که در گياهان به عنوان يک محصول فتوسنتزي در پلاستيدها3ي برگ گياهان ساخته و به عنوان منبع انرژي در زمان تاريکي مصرف ميشود. همچنين در آميلوپلاستها4ي غده، دانه و ريشه به عنوان يک ترکيب براي ذخيره سازي طولاني مدت سنتز ميشود. آميلوپلاست در بعضي موارد به اندازه 70% ماده تر5 گياه از نشاسته تشکيل شده است و مقدار زياد نشاسته ميتواند به صورت گرانولهاي محلول در آب تجمع يابد. اندازه، شکل و درجه کريستاله شدن گرانولها اغلب به گونههاي گياهي که در آن تشکيل شده است، بستگي دارد (شکل 1-2) (Aiyer et al.,2005; Sharma et al., 2013(1); Van (Der Maarel et al., 2002

شکل 1-2) گرانول نشاسته در گياهان مختلف (الف: نشاسته سيب زميني شيرين، ب: نشاسته سيب زميني، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج)

نشاسته پليساکاريدي ناهمگن6 است و از دو جزء آميلوز7 و آميلوپکتين8 با وزن ملکولي بالا تشکيل شده است؛ بطوري که به ترتيب 25-28% و 72-75% از گرانولهاي نشاسته را تشکيل ميدهند. آميلوز، پليساکاريد نامحلول در آب با زنجيره خطي D-گلوکز با اتصال (?(1–>4 است؛ ولي آميلوپکتين، پليساکاريد منشعب و محلول در آب است که از زنجيره اصلي با اتصال (?(1–>4 و زنجيره جانبي با اتصال (?(1–>6 به زنجيره اصلي تشکيل شده است(Sharma et al., 2013(1)).

شکل 1-3) ساختار آميلوز (الف) و آميلوپکتين(ب).

1-4- آميلازها
آميلازها آنزيمهايي هستند که مولکول نشاسته را هيدوليز و به محصولات متنوع از جمله دکسترين و به تدريج به اليگومرهاي کوچکتر داراي واحدهاي گلوکز تبديل ميکنند. اين آنزيم داراي اهميت زيادي با برنامههاي بيوتکنولوژي گستردهاي در صنايع نان ، مواد غذايي، نساجي و کاغذ ميباشد. آميلاز حدود 25 درصد از بازار آنزيم را دارا ميباشد. آلفا-آميلازهايي با پايداري دمايي بالا کاربردهاي تجاري زيادي در صنايع پردازش نشاسته، توليد شربت و نوشيدني، حذف آهار پارچه در نساجي و توليد شوينده دارند. پايداري دمايي خصوصيت مطلوب اغلب آنزيمهاي صنعتي است. آلفا آميلازهاي استخراج شده از باکتريهايي مانند سويههاي باسيلوس ليکنيفورميس9، باسيلوس سويه ANT-610 و باسيلوس سويه ASMIA-211 داراي پايداري دمايي مناسبي ميباشند (Asgher et al., 2007; Arikan et al., 2008)

1-4-1- منابع آلفا آميلازها
به دليل نقش مهم آلفا آميلازها در متابوليسم کربوهيدراتها، اين آنزيمها توسط گياهان، جانوران و ميکروارگانيسمها توليد ميشوند. آميلاز باکتريايي و گياهي قرنهاست که به عنوان افزودنيهاي غذايي استفاده ميشود. منابع ميکروبي با توجه به مزيتهايي مانند کاهش قابل توجه هزينه و نياز به زمان و فضاي کمتر براي توليد انبوه، سهولت دستورزي آنزيم براي بهبود خصوصيات و همچنين سهولت بهبود و بهينه سازي فرايند به منظور توليد صنعتي آميلاز، بطور گسترده استفاده ميشود (;Souza et al., 2010 Sivaramakrishnan et al., 2006).

1-4-1-1- آميلازهاي باکتريايي
در ميان باکتريها، گونههاي باسيلوس به طور گستردهاي براي توليد آلفا-آميلاز مقاوم به حرارت به منظور رفع نيازهاي صنعتي استفاده ميشود. باسيلوس سوبتليس12، باسيلوس استرئوس ترموفيلوس13، باسيلوس ليکنيفورميس و باس?لوس آم?لوليکويي فس?نس14 به عنوان توليدکنندگان اصلي آلفا آميلاز شناخته شدهاند و به طور گستردهاي براي توليد تجاري آلفا آميلاز براي کاربردهاي مختلف استفاده ميشود (Sivaramakrishnan et al., 2006).

1-4-1-2- آميلازهاي قارچي
.در بين قارچها، تنها گونههايي از قارچهاي مزوفيل مانند آسپرژيلوس15 و پني سليوم16، آلفا آميلاز توليد ميکنند. گونههاي آسپرژيلوس انواع مختلفي از آنزيمهاي خارج سلولي توليد ميکنند که در بين اين آنزيمها، آميلازها داراي بيشترين اهميت صنعتي ميباشد (Hern?ndez et al.,2006). قارچهاي رشته اي مانند قارچ آسپرژيلوس اوريزه17 و آسپرژيلوس نايجر18 به طور گسترده در صنعت استفاده ميشوند. به عنوان مثال آسپرژيلوس اوريزه يک ميزبان مناسب براي توليد پروتئينهاي هترولوگ ميباشد. همچنين اين قارچ تا حد زيادي در توليد مواد غذايي مانند سس سويا، اسيدهاي آلي مانند اسيد سيتريک و اسيد استيک و آنزيمهاي تجاري از جمله آلفا آميلاز استفاده ميشود. آسپرژيلوس نايجر آلفا آميلازي توليد ميکند که تحمل شرايط اسيدي را دارد و اين ويژگي آنزيمي باعث اجتناب از آلودگي باکتريايي ميشود (Souza et al., 2010).

1-4-2- طبقه بندي آميلازها
آنزيمهاي هيدروليز کننده نشاسته به چهار گروه عمومي تقسيم ميشوند:
الف) اندو آميلازها19
ب) اگزو آميلازها20
ج) آنزيمهاي شاخه شکن21
د) تراسفرازها22

1-4-2-1- اندو آميلازها
اندو آميلازها آنزيمهايي هستند که پيوندهاي گليکوزيدي داخلي را هيدروليز ميکنند (Rana et al., 2013). آلفا آميلاز يا 1,4-? گلوکان -4-گلوکانوهيدرولاز (EC 3.2.1.1) متعلق به خانواده گليکوزيد هيدرولاز 1323 ميباشد و با برش (4-1)-D-? گليکوزيدي؛ اين آنزيم آميلوز و آميلوپکتين را هيدروليز ميکند و اليگوساکاريدهاي خطي يا منشعب با طول مختلف داراي کنفيگوراسيونهاي ? و ?-دکسترين24 و ?- گلوکز توليد ميکند (Sharma et al., 2013(1); Van Der Maarel et al., 2002).
1-4-2-2- اگزو آميلازها
اگزو آميلازها آنزيمهايي هستند که پيوندهاي گليکوزيدي نزديک به انتهاي غير احيا کننده را هيدروليز و محصولاتي با وزن ملکولي پايين مانند گلوکز و مالتوز توليد ميکنند (Rana et al., 2013).

گلوکوآميلازها25 (EC 3.2.1.3)و آلفا گلوکوزيدازها26 (EC 3.2.1.20) پيوندهاي (4,1)? و (6,1)? گليکوزيدي را هيدروليز و ?-گلوکز توليد مينمايند ( Horvathova et al., 2000; Rana et al., 2013).

بتا-آميلازها27 (EC 3.2.1.2) پيوند (4,1)? گليکوزيدي را هيدروليز و ?-مالتوز28 و ?-دکسترين29 توليد ميکنند (Rana et al., 2013) (تصوير 1-3).

1-4-2-3- آنزيمهاي شاخه شکن
آميلازهاي شاخه شکن آنزيمهايي هستند که تنها پيوند (1,6)? گليکوزيدي را هيدروليز ميکنند (Horvathova et al., 2000).

پولولانازها30 يا ?-دکسترين 6-گلوکونو هيدرولاز31 (E.C. 3.2.1.41) جزء آنزيمهاي شاخه شکن ميباشد که پيوندهاي داخلي (1,6)?- D گليکوزيدي موجود در پولولان32، ? -دکسترين33 و آميلوپکتين را هيدروليز کرده و مالتو تريوز توليد ميکند (Asha et al.,2013).

ايزوآميلازها34 (EC 3.2.1.68) پيوند (1,6)?-گليکوزيدي آميلوپکتين و پلي ساکاريدهاي مشابه و دکسترين منشعب را هيدروليز و مالتواليگوساکاريدهاي خطي توليد ميکند (Horvathova et al., 2000).

شکل 1-4) انواع آميلازها، عملکرد و محصول آنها.

1-4-3- ساختار آميلازها
به منظور بدست آوردن اطلاعاتي درباره ساختار و کونفورماسيون پروتئينها معمولاً از تکنيکهاي CD-اسپکتروسکوپي35، NMR36 و کريستالوگرافي اشعه X37 استفاده ميشود. آميلازها حاوي سه دُمين38 A، B و C هستند. دُمين A مرکز آنزيم و شامل يک ساختار مرکزي TIM-barrel 8(?/?) متشکل از 8 مارپيچ ? و 8 زنجيره ? موازي ميباشد. در تمامي آلفا آميلازها (مانند آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس) دُمين A داراي سه اسيد آمينه D231، E261 و D328 در جايگاه فعال ميباشد. دُمينهاي B و C در دو طرف دُمين A قرار دارند. دُمين B بين زنجيره سوم و مارپيچ سوم TIM-barrel قرار دارد و ساختاري نامنظم و شبيه ? تشکيل ميدهد. اين دُمين مسئول احتمالي تفاوت در پايداري و ويژگي سوبسترا ميباشد. دُمين C داراي موتيف کليد يوناني39 در انتهاي کربوکسيل پروتئين ميباشد (شکل 1-5). انتهاي کربوکسيل احتمالاً در انتقال از عرض غشاء، اتصال به نشاسته و پايداري دمايي آنزيم نقش دارد (sharma et al.2013 (1)). آلفا آميلازهايي که تاکنون شناخته شدهاند داراي حداقل يک يون کلسيم در حد فاصل دُمين A و B ميباشند البته استثنائاتي نيز وجود دارد. حضور يون کلسيم براي فعاليت و يا پايداري دمايي آنزيم ضروري است و اين يون به دليل دور بودن از جايگاه فعال، نقش ساختاري دارد. بسياري از ساختارها داراي يک يا چند يون کلسيم (Ca2+) هستند. اولين يون کلسيم (Ca ?) بسيار حفاظت شده است که در تمام خويشاوندان آلفا آميلاز وجود دارد. اين يون کلسيم ?، دُمين A را به دُمين B متصل و باعث پايداري ساختار جايگاه فعال ميشود و تشکيل جايگاه اتصال سوبسترا را کنترل ميکند. دومين يون کلسيم (Ca ??) در کنار Ca ? قرار دارد و به همراه يون سديم، Ca-Na-Ca سه تايي فلزي40 را ميسازند. اين ترکيب 3 گانه فلزي در بعضي از آميلازهاي باکتريايي ديده ميشود. کلسيم سوم (Ca ???) نيز در حد فاصل دُمين A و C بعضي آلفا آميلازها ديده ميشود (شکل 1-6). فقدان يونهاي فلزي در آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس تغييرات کونفورماسيوني مختلفي را اطراف سه تايي فلزي و جايگاه فعال ايجاد ميکند. علاوه بر يون کلسيم، يون کلريد (Cl-1) نيز در جايگاه فعال بعضي از آلفا آميلازها وجود دارد که بازده کاتاليتيک آنزيم را افزايش ميدهد. يون کلريد عمدتاً در آلفا آميلاز پستانداران وجود دارد(Nielsen et al., 1999; Sharma et al.2013 (1); Sharma et al.2013 (2)) .

شکل 1-5) دُمينهاي A، B و Cو اسيد آمينههاي کاتاليتيک در آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس

شکل 1-6) يونهاي کلسيم در ساختار آلفا آميلاز.

1-4-4- مکانيسم عمل آلفا-آميلاز
تمامي آلفا آميلازها داراي سه اسيد آمينه در جايگاه فعال (مانند D231، E261 و D328 در آلفا آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس) که از لحاظ توالي و ساختار سه بعدي بسيار حفاظت شده و براي فعاليت آنزيم ضروري ميباشند. معالعه روي اسيد آمينههاي کاتاليتيک (D193،E219 و D294) آلفا آميلاز توليد کننده مالتوتترااوز41 باکتري سودوموناس استوتزري42 نشان داد واکنش از کاتاليز اسيد- باز عمومي تبعيت ميکند. در اين آنزيم اتم اکسيژن زنجيره جانبي D193 بعنوان کاتاليست بازي (هسته دوست43) به اتم کربن 1 در چهارمين گلوکز حمله ميکند و حد واسط واکنش را تشکيل ميدهد. اسيد آمينه D294 به سوبسترا متصل ميگردد و به ايجاد انحراف و پيچش حلقه چهارمين گلوکز در موقعيت کربن 1 کمک ميکند تا واکنش تسهيل شود. زنجيره جانبي اسيد آمينه E219 به عنوان يک کاتاليست اسيدي (دهنده پروتون) عمل ميکند و با اتم اکسيژن در چهارمين گلوکز پيوند هيدروژني تشکيل ميدهد (شکل 1-7) ((1) Sharma et al., 2013).

شکل 1-7) اسيد آمينههاي کاتاليتيک جايگاه فعال آلفا آميلاز باکتري سودوموناس استوتزري.

1-4-5- کاربردهاي آلفا-آميلازها
آميلازها از جمله مهمترين آنزيمهاي جهان هستند که در بيوتکنولوژي روز دنيا اهميت بسياري دارند. اين دسته آنزيمي در زمينههاي مختلفي مانند باليني، داروسازي، شيمي تجزيه و همچنين صنايع مختلف مانند در صنايع توليد شربت گلوکز و فروکتوز از نشاسته، نساجي، کاغذ و توليد اتانل زيستي و غيره کاربرد دارد (Souza et al., 2010). بدليل اهميت صنعتي آميلاز، جداسازي سويههاي باکتريايي توليد کننده آميلاز مناسب براي کاربردهاي جديد صنعتي مانند آميلازهاي قليايي مناسب براي صنايع شوينده مورد توجه قرار گرفته است (Arikan et al., 2008).
چندين گونه از جنس باسيلوس و همچنين اکتينوميسس44 مقاوم به حرارت از جمله ترمومونوسپورا45 و ترمواکتينوميسس46 آنزيمهاي مختلفي توليد ميکنند. جنس باسيلوس انواع زيادي از آنزيمهاي خارج سلولي توليد ميکند که در ميان آنها پروتئاز و آميلاز از اهميت صنعتي قابل توجهي برخوردار است. آلفا آميلاز قليايي و بسيار مقاوم به حرارت از باسيلوس سويه PN5 به دست آمده است. باکتري گرمادوست باسيلوس استرئوترموفيلوس جايگزين مناسبي براي توليد تجاري آلفا آميلاز مقاوم به حرارت پيشنهاد شده است. مزاياي استفاده از آميلازهاي مقاوم به حرارت در فرايندهاي صنعتي شامل کاهش خطر آلودگي و همچنين حلاليت بهتر سوبسترا ميباشد و مزيت ديگر آن کاهش گرانروي47 است که اجازه تسريع مخلوط کردن و پمپاژ را ميدهد. وجود آميلازهاي قند ساز48 که در دماي بالا (C?90) فعال هستند، به طور مستقيم براي صنايع پردازش نشاسته مفيد ميباشد. با اين حال، فرآيندهاي در حال اجراي توليد آلفا آميلاز در دماي بالاتر نيازمند طراحي فرايندهاي جديد و داشتن دانش بيشتر درباره باکتريهاي گرمادوست ميباشد. گونههاي باسيلوس قليا دوست اغلب آنزيمهايي مانند آميلاز، پروتئاز و کربوکسي متيل سلولاز قليايي توليد ميکنند که در pH قليايي فعال هستند (Arikan et al., 2008).

1-4-5-1- توليد اتانل زيستي
به دليل نياز به توليد سوخت از منابع تجديد پذير، توليد اتانل زيستي از نشاسته به شدت افزايش يافته است. در صنعت با استفاده از مواد حاوي نشاسته مانند دانه ذرت، گندم، سيب زميني، ريشه گياه کاساوا49 و برگ و ساقه گياه ذرت اتانل توليد ميشود. اغلب مخمرها نميتوانند کربوهيدرات گياهان حاوي نشاسته را بطور مستقيم تخمير کنند. بنابراين نشاسته ابتدا آسياب و سپس هيدراته و ژلاتينه ميشود. در ادامه توسط آنزيمها به قندهاي قابل تخمير تبديل ميشود. ولي استفاده از سويه مهندسي ژنتيک شده مخمر که داراي قابليت تبديل مستقيم نشاسته به اتانل ميباشد، از لحاظ وقت و هزينه مقرون به صرفه ميباشد. بطور مثال اگر آميلاز جو در ساکارومايسس سروزيه50 بيان شود، مخمر ميتواند نشاسته را به اتانل تبديل کند و هزينه توليد صنعتي به ميزان زيادي کاهش مييابد (Nigam et al.,1995; Rana et al., 2013).

1-4-5-2- صنايع شوينده
صنايع شوينده اولين مصرف کننده آنزيمها از نظر مقدار و هزينه ميباشد. استفاده از آنزيمها در شوينده باعث افزايش توانايي حذف لکه ميشود و از لحاظ محيط زيست نيز ايمن محسوب ميشود. امروزه بسياري از مواد لباسشويي حاوي مخلوطي از آنزيمهايي مانند پروتئاز، آميلاز، سلولاز و ليپاز هستند. به دليل هيدروليز پيوندهاي گليکوزيدي ملکول نشاسته موجود در لکههاي مواد غذايي، آميلاز پس از پروتئاز دومين آنزيمي است که در صنعت شوينده استفاده ميشود. به علت چسبيدن مواد به نشاسته، حذف نشاسته از سطح لباس يا ظروف به تميز شدن آن کمک ميکند. بين آنزيمهايي که براي شوينده استفاده ميشود آلفا آميلازها پرمصرف ترين ميباشد. آميلازهاي داراي فعاليت در pH قليايي و دماي بالا و داراي پايداري لازم در شوينده و پايداري اکسيداتيو مهمترين شرايط براي استفاده از آنزيم در شوينده ميباشد. اغلب آميلازهاي تجاري از جنس باسيلوس يا آسپرژيلوس بدست ميآيند ( Souza et al., 2010;Hmidet et al., 2009).

1-4-5-3- صنايع نساجي
آميلاز در صنعت نساجي براي فرآيند حذف آهار51 استفاده ميشود. آهار را قبل از توليد پارچه به نخ اضافه ميکنند تا از آسيبهاي ناشي از سرعت بافتن جلوگيري و از استحکام پارچه مطمئن شوند. نشاسته به دليل قيمت ارزان، در دسترس بودن و حذف آسان، بسيار مناسب آهار ميباشد. پس از بافت پارچه، نشاسته طي فرايندي از آن حذف ميشود. آلفا آميلاز ميتواند بطور انتخابي آهار را حذف کند اما به الياف پارچه آسيب نرساند. مدت زيادي است که آميلازهاي سويههاي باسيلوس در صنايع نساجي مورد استفاده قرار ميگيرند (Souza et al., 2010).

1-4-5-4- کاغذ سازي
به منظور استحکام کاغذ و محافظت از آن در برابر آسيبهاي مکانيکي طي روند توليد از نشاسته داراي گرانروي کم استفاده ميشود. به اين منظور ابتدا نشاسته توسط آلفا آميلاز بطور جزئي هيدروليز و سپس در دماي حدود C?60-45 به کاغذ اضافه ميشود (Mojsov et al., 2012).

1-4-5-5- صنايع غذايي
آميلاز داراي کاربردهاي گستردهاي در صنايع پردازش مواد غذايي مانند توليد نان، کيک و آب ميوه و همچنين توليد شربت گلوکز و فروکتوز از نشاسته ميباشد. آميلاز براي هيدروليز غذاي دام به منظور سهولت هضم آن مورد استفاده قرار ميگيرد. بعضي از آميلازها به دليل توانايي شيرينکنندگي بالا، به عنوان جايگزين شيرين کنندهها در غذاها و نوشيدنيها مورد استفاده قرار ميگيرد (Mojsov et al., 2012; Nigam et al., 2002).
1-5-4-6- توليد نان و شيريني پزي
به دليل داشتن مزاياي زياد استفاده از آنزيم و نداشتن اثرات جانبي افزودنيها، استفاده از آنزيم در صنعت پخت نان تقريبا عمومي شد. بين آنزيمها، آميلاز، ليپاز، پروتئاز، هميسلولاز، پنتوزانوز52 و اکسيداز بيشتر مورد استفاده قرار ميگيرند. اين آنزيمها هيدروليز نشاسته، کربوهيدرات غير نشاستهاي، چربيها و پروتئينها را کاتاليز ميکنند. از آلفا آميلازها بيش از ساير آنزيمها در پخت نان استفاده ميشود که به دليل افزايش حجم نان، بهبود دانههاي نان، رنگ و پوسته نان، بهتر شدن عطر و طعم محصول نهايي ميباشد. اخيراً اثر ضد بياتشدگي53 در هنگام استفاده از آلفا آميلاز مشاهده شد که اين اثر به علت به تأخير انداختن کريستاله شدن آميلوپکتين در طول ذخيرهسازي نان است. با اين حال، تنها آلفا آميلاز باکتريايي داراي پايداري حرارتي متوسط ميتواند براي جلوگيري از بيات شدن نان مورد استفاده قرار گيرد (Rosell et al., 2001).
1-4-5-7- توليد شربت گلوکز و فروکتوز
يکي ازمهمترين کاربردهاي آلفا آميلاز تبديل نشاسته به شربت گلوکز و فروکتوز است. اين فرايند شامل مراحل ژلاتينه شدن54، سيال شدن55 نشاسته و تبديل به منوساکاريدها56 ميباشد (شکل 1-8). مايع شدن و تبديل به منوساکاريد نياز به هيدروليز آنزيمي دارند. در مرحله سيال شدن نشاسته ابتدا آلفا آميلاز بدست آمده از باسيلوس آميلوليکويي فَسيِنس مورد استفاده قرار گرفت ولي در ادامه آلفا آميلاز استخراج شده از باسيلوس استرئوترموفيلوس و باسيلوس ليکنيفورميس جايگزين آن شدند (Rana et al., 2013).

شکل 1-8) مراحل تبديل نشاسته به شربت

فصل دوم
(مروري بر پژوهشهاي پيشين)

2- مروري بر پژوهشهاي پيشين
اولين آنزيم تجزيه کننده نشاسته در سال 1811 توسط Kirchhoff کشف شد( Gupta et al., 2003).
در سال 1925 Kuhn و همکاران با محاسبه چرخش نوري، محصول اوليه توليد شده توسط آميلازهاي پانکراس و آسپرژيلوس اوريزه را آلفا- مالتوز و محصول توليد شده توسط آميلاز مالت را بتا- مالتوز ناميد (Kuhn et al., 1925).
در سال 1930 Ohlsson آنزيمهاي تجزيهکننده نشاسته در مالت را طبق تيپ آنومري قندهاي احياء شونده به آلفا و بتا آميلاز دستهبندي کرد (Ohlsson et al., 1930).
در سال1982 Krishnan و همکاران از باسيلوس ليکنيفورميس سويه CUMC305 يک آلفا آميلاز با وزن ملکولي kDa 28 خالص کردند. آنزيم استخراج شده در دماي oC90 و 0/9pH~ داراي فعاليت بهينه بود. همچنين مقاومت دمايي بالايي را از خود نشان داد (Krishnan et al.,1982).
در سال 1983 Mielenz و همکاران، ژن آلفا آميلاز داراي پايداري دمايي از باکتري گرمادوست باسيلوس استئوترموفيلوس کلون57 و در اشرشيا کلي58 بيان کردند (Mielenz et al.,1983).
در سال 1986 Rothstein و همکاران توليد آلفا آميلاز از باسيلوس ليکنيفورميس را بررسي کردند. در اين پژوهش توليد آنزيم بيش از 100 برابر به حضور يا عدم حضور منبع کربن مهار کننده کاتابوليت در محيط بستگي داشت. در اين باکتري آلفا آميلاز در طي فاز نمايي توليد گرديد (Rothstein et al.,1986).
در سال 1998 Igarashi از باسيلوس سويه KSM-1378 يک آلفا آميلاز استخراج کرد که وزن مولکولي آن 53 کيلو دالتون بود. فعاليت بهينهي اين آنزيم در0/8-5/8 pH و دماي oC55 بود. اين آنزيم با بازده بالايي کربوهيدراتهاي مختلف را به مالتوز يا مالتو پنتوز تبديل کرد (Igarashi et al., 1998).
در سال 1999 Mamo و همکاران دو آميلاز، با عنوان AmyI و AmyII را از باسيلوس سويه WN11 خالص کردند. وزن مولکولي آنها به ترتيب 76 و kDa 53 برآورد شد. دماي بهينه فعاليت هر دو آنزيم C?80- 75 بود و در 5/5~ pH بيشترين فعاليت را داشت. همچنين در محدوده pH 0/9 – 5/5 پايدار بود. فعاليت اين آنزيمها در حضور +2Hg، +2Cu و +2Fe مهار شد، اما اثر مهاري در حضور +2Zn مشاهده نشد (Mamo et al., 1999).
در سال 2002 Dey و همکاران با مطالعه باسيلوس سيرکولنس59 GRS 313، آلفا آميلازي جدا کردند که نشاسته را به مالتو ترياوز و مالتو پنتااوز تبديل کرد. دما و pH بهينه آنزيم به ترتيب C? 48 و 9/4 بود. آنزيم تا دماي C? 60 و pHهاي0/8-0/5 پايدار بود (Dey et al., 2002).
در سال 2007 Saxena و همکاران روي آلفا آميلاز قليايي باسيلوس سويه PN5 مطالعهاي انجام دادند. اين آنزيم بيشترين فعاليت در 0/10~ pHو دماي C? 90 دارا بود. فعاليت آنزيم پس از يک ساعت نگهداري در 0/10~ pH، 80% فعاليت اوليه است. با گرما دهي در دماي C? 80-100به مدت 1 ساعت آنزيم کاملاً پايدار بود؛ اما در C? 105، 65% فعاليت آن باقي ماند (Saxena et al., 2007).
در سال 2007 Asgher و همکاران از باسيلوس سوبتليس JS-2004 آلفا آميلازي را استخراج کردند و اثر کلسيم، عصاره مخمر و گلوکز موجود در محيط کشت بر رشد باکتري و توليد آنزيم مطالعه شد. اين سويه پس از 48 ساعت کشت در محيط داراي 0/7~ pH و دماي C? 50 حداکثر توليد آنزيم (U/mL 72) را داشت. افزودن کلسيم و عصاره مخمر رشد باکتري و توليد آنزيم را افزايش داد؛ اما افزودن گلوکز %1 اثر مهاري زيادي نشان داد. عصاره آلفا آميلاز داراي بيشترين فعاليت در دماي C? 70 و در 0/8~ pH بود و پس از يک ساعت در دماي C? 70 کاملاً پايدار بود (Asgher et al., 2007).

در سال 2008 Arikan و همکاران مطالعهاي را روي آلفا آميلاز قليايي و داراي پايداري دمايي توليد شده توسط باسيلوس سويه A3-15 انجام دادند. SDS-PAGE دو نوار را در kDa 86 و 5/60 نشان داد. آنزيم پس از تخليص جزئي بيشترين فعاليت را در 11 pH و دماي C? 70 نشان داد. اين آنزيم در محدوده قليايي (5/11-0/10) فعاليت زيادي داشت و تا C? 100 کاملاً فعال بود (Arikan et al., 2008).
در سال 2009 Hmidet و همکاران روي باسيلوس ليکنيفورميس سويه NH1که پنج پروتئاز و يک آلفا آميلاز توليد ميکرد، مطالعهاي انجام دادند. pH و دماي بهينه آميلاز به ترتيب 5/6 و C? 90 است. اين آلفا آميلاز داري پايداري دمايي مناسبي بود و هنگامي که با سورفکتانتهاي يوني و غير يوني به مدت 1ساعت در C? 40 دما دهي شد، پايدار ماند (Hmidet et al., 2009).
در سال 2010 Bo?i? و همکاران با مطالعه روي باسيلوس ليکنيفورميس ATCC 9945a آلفا آميلازي با قابليت بالاي هيدروليز نشاسته خام توليد کردند. با استفاده از SDS-PAGE وزن مولکولي آنزيم kDa 31 نشان داده شد. بهينه pH آنزيم خالص شده 5/6 و بهينه دماي آنC ? 90 بود. نشاسته خام بدست آمده از Triticale، گندم، سيب زميني، ترب سياه60 و ذرت در غلظت 1% را به مدت h 4 در معرض آنزيم قرار داد و ميزان هيدروليز به



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید